论文摘要：为了建立苹果砧木“中砧1号”的茎尖离体保存技术，本实验以M9和富士为对照，研究了培养基中添加不同浓度蔗糖或生长抑制剂对试管苗生长速率的影响以及包埋干燥法和玻璃化法预处理对试管苗茎尖超低温保存效果的影响。结果显示：不添加生长抑制剂，蔗糖浓度为20g·L 时，中砧1号试管苗离体保存效果比较好。常规培养基（蔗糖浓度30g·L ）中添加5mg·L 的CCC、0.1mg·L 的ABA或60mg·L 的B9，也可以达到相同的效果。用包埋干燥法和PVS3玻璃化液预处理，中砧1号超低温保存后的茎尖再生率较高。

　　论文关键词：苹果，砧木，离体保存，超低温保存

　　中砧1号（Zhongzhen1）是本实验室历时25年从小金海棠（MalusxiaojinensisChengetJiang）中选育出的耐缺铁黄化苹果砧木新品种，其亲本小金海棠是四倍体（2n=4x=68）野生种质资源，具有耐盐碱、耐热、耐旱、耐涝、抗寒（-45℃）、抗白粉病等特性。中砧1号与富士、金冠、国光等苹果主栽品种的嫁接亲和性好，具有较强的无融合生殖特性，去雄套

　　E-mail:hanshahappy@163.com

　　★通讯作者：韩振海（1963-），男，中国农业大学教授，博士生导师。E-mail:rschan@cau.edu.cn

　　袋后花朵坐果率为86.7%，实生苗整齐一致。但中砧1号果实结籽率较低，平均每果饱满

　　种子数仅0.9粒，约需200kg果实出1kg种子。由于无融合生殖率未能达到100%，种子

　　产量低两方面原因，目前中砧1号在生产上尚不能实现实生繁殖。

　　采用茎尖分生组织培养技术快速繁殖的中砧1号苗木具有质量好，繁殖速度快，避免病毒侵染等优点。但实践中存在两方面问题，一是多代继代繁殖易引起遗传变异和表遗传变异的积累；二是每次重新取材新建试管无性系的周期较长。为避免上述问题，目前常采用试管苗低温和超低温保存两条途径，前者适用于中短期保存，后者适用于长期保存。

　　通过调节培养条件，抑制保存材料的生长、减少营养消耗来实现延长继代培养时间是植物种质离体保存的重要方法之一。具体途径有低温、高渗透压、加生长抑制剂、降低氧分压、调整培养基中营养的浓度等。蔗糖不易被外植体吸收，高浓度蔗糖提高了培养基的渗透势负值，造成水分逆境，从而降低细胞膨压，使细胞吸水困难，减弱新陈代谢，生长减缓。另外，常用的的生长抑制剂有矮壮素（CCC）、脱落酸（ABA）、多效唑（PP333）、甲基丁二酸（MSA）、缩节胺（pix）等。

　　玻璃化法和包埋干燥法是果树作物超低温保存常用的处理方法。包埋干燥法保存苹果品种的离体茎尖可以获得较高的存活率。玻璃化的关键在于玻璃化液及材料在玻璃化保护剂中的脱水时间。玻璃化液的种类有PVS1（15%二甲基亚砜+22%甘油+13%聚乙二醇+13%乙二醇）、PVS2（30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖）、PVS3（50%甘油+50%蔗糖）、PVS4（30%甘油+10%二甲基亚砜+25%聚乙二醇）和PVS5（15%甘油+15%甘露醇+13%二甲基亚砜+15%甘露醇+15%乙二醇）等。由于冰冻保护剂对植物组织有一定的毒害作用，所以冰冻保护剂的选择、成分配比及处理时间需要进行严格的筛选试验，以其达到最高成活率。

　　同属不同种的材料离体保存成活率有差异，影响植物材料离体保存的因素很多，不同植物，同一植物不同类型的材料，其保存的难易不同。目前中砧1号尚未建立低温、超低温保存技术体系。本试验主要通过缓慢生长法和超低温保存法对中砧1号进行离体保存，建立低温和超低温保存方法。

　　1材料和方法

　　1.1试验材料

　　中砧1号（Zhongzhen1）、M9、富士（Fuji）

　　中砧1号扩繁培养基为MS+BA0.5mg·L+IBA0.5mg·L；M9扩繁培养基为MS+BA

　　0.6mg·L+IBA0.3mg·L；富士扩繁培养基为MS+BA1.0mg·L+NAA0.05mg·L；其中蔗糖30g·L，琼脂7g·L。培养温度为23±2℃，光照2000lx，光照时间为14h·d。

　　1.2试验方法

　　1.2.1低温保存

　　蔗糖处理：将待保存培养苗接种在分别加入20、30（ck）、40、60、80g/l不同浓度蔗糖的MS培养基的试管中。

　　CCC处理：将待保存培养苗接种在分别加入0（ck）、5、15、25、35mg/l不同浓度CCC的常规MS培养基的试管中。

　　ABA处理：将待保存培养苗接种在分别加入0（ck）、0.1、0.4、0.7、1.0mg/l不同浓度ABA的常规MS培养基的试管中。

　　B9处理：将待保存茎段培养苗接种在分别加入0（ck）、60、80、100、120mg/l不同浓度B9的常规MS培养基的试管中。

　　将待保存培养苗分别接种在含有上述物质的MS培养基中，每个试管接种1株，5次重复，接种后的试管用牛皮纸封口，放在光强2000lx，温度23±2℃，光照时间14h·d培养10天后，转到光照500lx、温度为4±2℃、全天光照下进行培养。4个月以后，用直尺测量植株高度，计算得出植株生长率（生长率=（最终植株高度-原初植株高度）/原初植株高度），使用Excel和SPSS数据分析软件对实验数据进行分析。

　　1.2.2超低温保存

　　继代培养60d以上的材料置于4℃预培养驯化1个月，剥茎尖分别进行包埋干燥法和玻璃化法预处理。

　　包埋干燥法：将茎尖置于MS+0.3mol·l蔗糖的固体培养基4℃预培养1d，用滴管吸取含一个茎尖的液体转移至100mmol·lCaCl及0.1、0.3、0.5mol·l蔗糖的培养液中分别包埋2、3、4、5h，无菌空气干燥，装2.0ml冷冻管，每管装10个茎尖，迅速投入液氮。每个处理20-30个茎尖，3次重复。

　　玻璃化法：将茎尖置于MS+0.7mol·l蔗糖的固体培养基4℃预培养1d，装2.0ml冷冻管，每管装10个茎尖，在室温下用60%的玻璃化溶液PVS2装载30min，分别在PVS2、PVS3、PVS4、PVS5中0℃处理30、60、90、120min，移去原液，装入新鲜的保护液迅速投入液氮。每个处理20-30个茎尖，3次重复。

　　材料经超低温保存至少24h后取出冷冻管，25℃水浴化冻2min，蔗糖浓度为1.2mol·l的MS培养液洗涤，将茎尖接种到恢复培养基MS+BA0.6mg·L+NAA0.1mg·L+GA0.5mg·L中，暗培养一周，转移到光下培养，以形成叶或嫩芽为存活标准，统计再生率。

　　2结果与分析

　　2.1不同浓度蔗糖对试管苗生长速率的影响

　　表1不同浓度蔗糖对试管苗生长速率的影响

　　Table1Effectofdifferentconcentrationofsucroseongrowthrateofinvitroshoots

　　浓度

　　Concentration

　　/g·L

　　生长率 Growth rate/%

　　中砧1号

　　（Zhongzhen1）

　　M9

　　富士

　　（Fuji）

　　20

　　0.0240±0.0537d

　　0.0570±0.0850c

　　0.0210±0.0305c

　　30

　　2.6780±0.8933b

　　4.8840±0.4255a

　　1.4840±0.3015b

　　40

　　1.0640±0.0802c

　　2.5300±0.4021b

　　2.9590±0.3967a

　　60

　　3.8540±0.1286a

　　0.0000±0.0000c

　　0.0000±0.0000c

　　80

　　0.0160±0.0358d

　　—

　　0.0012±0.0027c

　　注：—为茎尖或植株死亡。数据采用LSD方差分析方法，小写字母表示不同处理间的差异显著性（P）。下同。

　　Note:-Meansshoottipsorplantsweredeath.DatawasanalyzedwithLSDtest,lettersinthesamecolumnmeansignificantdifferenceat0.05level.Thesamebelow.

　　蔗糖浓度对中砧1号试管苗生长速率有显著影响。与常规培养基（30g·L）相比，高浓度蔗糖（80g·L）和低浓度蔗糖（20g·L）均显著抑制中砧1号试管苗生长，20g·L和80g·L蔗糖中砧1号生长速率最低。M9和富士试管苗对蔗糖浓度的反应与中砧1号基本一致。20g·L和60g/L蔗糖浓度时M9生长速率最低，蔗糖浓度达到80g·L时植株茎尖出现死亡；蔗糖浓度为20g·L、60g·L和80g·L时富士试管苗生长均缓慢。中砧一号试管苗低温保存适宜的蔗糖浓度为20g·L。

　　2.2不同浓度CCC对试管苗生长速率的影响

　　表2不同浓度CCC对试管苗生长速率的影响

　　Table2EffectofdifferentconcentrationofCCCongrowthrateofinvitroshoots

　　浓度

　　Concentration

　　/mg·L

　　生长率 Growth rate/%

　　中砧1号

　　（Zhongzhen1）

　　M9

　　富士

　　（Fuji）

　　0

　　2.6780±0.8933a

　　4.8840±0.4255a

　　1.484±0.3015a

　　5

　　0.4400±0.6066b

　　0.2400±0.1949b

　　0.8440±0.0832b

　　15

　　0.3760±0.4244b

　　0.0357±0.0489b

　　0.0520±0.1163c

　　25

　　0.1440±0.1983b

　　0.0260±0.0371b

　　0.0600±0.0894c

　　35

　　0.0000±0.0000b

　　0.0000±0.0000b

　　—

　　CCC浓度对中砧1号试管苗生长速率有显著影响。培养基中加入低浓度CCC（5mg·L）就能显著抑制中砧一号试管苗生长。M9和富士试管苗对CCC的反应与中砧1号基本一致，即CCC浓度为5mg·L时，就可以对M9试管苗起到明显的抑制作用；浓度达到15mg/L时，对富士试管苗抑制作用明显，但高浓度产生毒害作用，茎尖死亡。中砧一号试管苗低温保存适宜的CCC浓度为5mg/L。

　　2.3不同浓度ABA对试管苗生长速率的影响

　　表3不同浓度ABA对试管苗生长速率的影响

　　Table3EffectofdifferentconcentrationofABAongrowthrateofinvitroshoots

　　浓度

　　Concentration

　　/mg·L

　　生长率 Growth rate/%

　　中砧1号

　　（Zhongzhen1）

　　M9

　　富士

　　（Fuji）

　　0

　　2.6780±0.8933a

　　4.884±0.4255a

　　1.484±0.3015a

　　0.1

　　0.2040±0.1266b

　　0.0158±0.0246b

　　0.0312±0.0455b

　　0.4

　　0.0000±0.0000b

　　0.0300±0.0415b

　　—

　　0.7

　　0.0820±0.0829b

　　0.0000±0.0000b

　　—

　　1.0

　　—

　　0.0183±0.0309b

　　—

　　ABA浓度对中砧1号试管苗生长速率有显著影响。低浓度0.1mg·L对中砧1号有明显的抑制作用。M9与富士对ABA浓度的反应与中砧1号完全一致，浓度达到0.4mg·L时，富士植株茎尖死亡。

　　2.4不同浓度B9对试管苗生长速率的影响

　　表4不同浓度B9对苹果品种和砧木试管苗生长率的影响

　　Table4EffectofdifferentconcentrationofB9ongrowthrateofinvitroshoots

　　浓度

　　Concentration

　　/mg·L

　　生长率 Growth rate/%

　　中砧1号

　　（Zhongzhen1）

　　M9

　　富士

　　（Fuji）

　　0

　　2.6780±0.8933a

　　4.8840±0.4255a

　　1.4840±0.3015a

　　60

　　1.3120±0.1907b

　　0.5000±0.1163b

　　0.030±0.0412b

　　80

　　—

　　0.0520±0.5385b

　　0.0000±0.0000b

　　100

　　—

　　—

　　—

　　120

　　—

　　—

　　—

　　B9浓度对中砧1号试管苗生长速率有显著影响。浓度为60mg·L时，中砧1号就能表现出明显的抑制作用。M9与富士对B9浓度的反应与中砧1号基本一致。浓度达到80mg·L时，中砧1号植株茎尖死亡，而M9和富士试管苗在B9浓度为100mg·L时茎尖死亡，不适合保存。

　　2.5包埋干燥法预处理对离体茎尖再生率的影响

　　表5包埋干燥法对离体茎尖再生率的影响

　　Table5Regenerationrateofshoottipsafterencapsulation-dehydration

　　预培养蔗糖浓度

　　Preculture

　　sucrose concentration

　　/mol·l

　　再生率 Regeneration rate/%

　　包埋时间

　　Encapsulat-

　　ion time /h

　　中砧1号

　　（Zhongzhen1） /%

　　M9

　　/%

　　富士

　　（Fuji） /%

　　0.1

　　2h

　　0.2400±0.0346gFG

　　0.2467±0.0416e

　　0.3000±0.0529ef

　　3h

　　0.2600±0.0200gEF

　　0.3867±0.0611cd

　　0.1333±0.1172gF

　　4h

　　0.2600±0.0346gEF

　　0.3733±0.0416cd

　　0.4800±0.0529bc

　　5h

　　0.1533±0.0231h

　　0.4467±0.0115bc

　　0.6333±0.1102a

　　0.3

　　2h

　　0.6400±0.0529b

　　0.3600±0.0529dCD

　　0.5200±0.0000bc

　　3h

　　0.5800±0.0000bc

　　0.6067±0.0503a

　　0.5067±0.0306bc

　　4h

　　0.7133±0.0416a

　　0.6067±0.0643a

　　0.5467±0.0808ab

　　5h

　　0.5667±0.0416cd

　　0.6333±0.0115a

　　0.3533±0.0231de

　　0.5

　　2h

　　0.4933±0.0503e

　　0.4867±0.0416b

　　0.2200±0.0000fg

　　3h

　　0.5067±0.0611de

　　0.3133±0.0115de

　　0.4133±0.0924cd

　　4h

　　0.3733±0.0757fD

　　0.3467±0.0416dC

　　0.2533±0.0306ef

　　5h

　　0.3400±0.0000fDE

　　0.3800±0.0872cdB

　　0.2200±0.0346fg

　　各个试验处理对中砧1号离体茎尖再生率有显著差异，预培养蔗糖浓度0.3mol·l，包埋干燥时间为4h时，恢复生长率最高，为71.33%。在同一处理下，M9和富士恢复生长率也较高，分别为60.67%和54.67%。M9预培养蔗糖浓度为0.1mol·l，包埋干燥时间为3h、4h、5h三个处理之间没有显著差异。预培养蔗糖浓度0.1mol·l，包埋时间5h时，富士茎尖恢复生长率最高。

　　2.6玻璃化法对离体茎尖再生率的影响

　　表6玻璃化法对离体茎尖再生率的影响

　　Table6Regenerationrateofshoottipsaftervitrification

　　玻璃化液

　　Vitrification solution

　　再生率 Regeneration rate/%

　　处理时间

　　Treatment time/min

　　中砧1号

　　（Zhongzhen1） /%

　　M9

　　/%

　　富士

　　（Fuji） /%

　　PVS2

　　30

　　0.5267±0.0306cd

　　0.2667±0.0306d

　　0.2667±0.0306d

　　60

　　0.7367±0.0321a

　　0.2433±0.0551de

　　0.2433±0.0551de

　　90

　　0.6267±0.0252b

　　0.2000±0.0173f

　　0.2000±0.0173f

　　120

　　0.4100±0.0529eF

　　0.2600±0.0100de

　　0.2600±0.0100de

　　PVS3

　　30

　　0.3533±0.0351fFG

　　0.2533±0.0503de

　　0.2533±0.0503de

　　60

　　0.5600±0.0200c

　　0.4867±0.0306b

　　0.4867±0.0306b

　　90

　　0.7333±0.0208a

　　0.6733±0.0208a

　　0.6733±0.0208a

　　120

　　0.4200±0.0100eEF

　　0.3233±0.0252c

　　0.3233±0.0252c

　　PVS4

　　30

　　0.3667±0.0252ef

　　0.1467±0.0252f

　　0.1467±0.0252f

　　60

　　0.3133±0.0058fGH

　　0.3367±0.0231c

　　0.3367±0.0231c

　　90

　　0.1467±0.0306i

　　0.7133±0.0208a

　　0.7133±0.0208a

　　120

　　0.0633±0.0231jL

　　0.4600±0.0265b

　　0.4600±0.0265b

　　PVS5

　　30

　　0.2500±0.0400g

　　0.2400±0.0100de

　　0.2400±0.0100de

　　60

　　0.2067±0.0289gh

　　0.2067±0.0603ef

　　0.2067±0.0603ef

　　90

　　0.1533±0.0153hi

　　0.1867±0.0551gh

　　0.1867±0.0551gh

　　120

　　0.0770±0.0709jKL

　　0.1833±0.0058hi

　　0.1833±0.0058hi

　　各个试验处理对中砧1号离体茎尖再生率有显著差异。

　　PVS2处理60min、PVS3处理90min均能获得较高的恢复生长率。M9和富士在PVS3处理90min时成活率较高，均为67.33%。与中砧1号不同的是两者在PVS4处理90min时，能获得最高的恢复生长率。

　　3讨论

　　依据本研究结果，20mg·L是中砧1号试管苗离体保存培养基中的最佳蔗糖浓度。高浓度和低浓度蔗糖均可显著抑制试管苗生长。一般认为蔗糖浓度变高，培养基的渗透压增加超过了可承受的范围，养分水分吸收受阻，从而抑制生长。百合种质资源离体保存中，蔗糖浓度提高到50-90mg·L，有效抑制植株生长，试管苗可保存11个月以上。培养基中加入低浓度蔗糖，植物材料处于半饥饿状态，有效地获得减缓生长的效果，从而达到延长保存期的目的。低浓度蔗糖与高浓度蔗糖都具有抑制生长的良好效果，从节省成本考虑，采用低浓度蔗糖为宜。

　　培养基中添加的CCC浓度为5mg·L时中砧1号试管苗离体保存效果最佳。枇杷的种质保存中，25mg·L的CCC较合适，过高浓度的CCC对枇杷生长抑制作用明显，但会导致死亡率上升，不利于枇杷种质的保存；而在另一些植物种质保存中，CCC应用浓度则比较高，如CCC浓度为10-40mg·L时，对百合种质无抑制作用；而在葡萄种质离体保存中，CCC浓度为60-90mg·L是适宜的。

　　培养基中添加的ABA浓度为0.1mg·L时中砧1号试管苗离体保存效果最佳。在猕猴桃种质保存试验中，ABA的应用浓度比较低，合适浓度为0.1-0.5mg·L，有效延长继代间隔时间，保存8个月，存活率在53%以上。而另一些植物上，ABA应用浓度则比较高，在百合种质资源离体保存中，ABA浓度为1.0-3.0mg·L，对百合试管苗生长的抑制效果较好，以1.0mg·LABA最为适宜。3-10mg·L的ABA抑制枇杷植株的生长是适宜的。

　　本研究认为B9的抑制作用比较强烈，只有低浓度60mg·L时，可以保存中砧1号，但是80mg·L因为抑制过度而死亡。郭延平等在培养基中加入50mg·L的B9和0.1mg·L的ABA在室温下将称猴桃的试管苗保存了9个月。

　　因此，不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差异，同一种抑制剂应用在不同的植物中，要达到抑制作用而不对植物造成伤害所需要的量也有所不同。

　　Sakai等认为PVS2处理苹果、梨、苜蓿等效果最佳。在香蕉种质保存中发现PVS2的效果最好，PVS1次之，而PVS3和PVS4的成活率几乎为零。本试验用PVS2、PVS3玻璃化法保存中砧1号离体茎尖，均得到较高存活率。但包埋干燥法的存活率与玻璃化法没有明显差异，而包埋干燥法茎尖没有恢复期，可以直接生长，并且一次可以处理大量茎尖，因此，包埋干燥法更适用于中砧1号的超低温保存。

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